納米醫(yī)學（Nanomedicine，NMs）致力于通過改造納米材料開發(fā)新的治療工具，將藥物或診斷試劑靶向輸送到病變部位，從而打破診斷和治療醫(yī)學發(fā)展的困境。近幾十年來，無數(shù)的研究成果革新了治療的方式，豐富了高精度診斷方法。未來，納米藥物甚至可以通過調(diào)整其表面化學性質(zhì)、形狀和大小以及識別群體來實現(xiàn)個性化的治療和診斷，從而達到理想的治療效果。納米藥物的藥物評價對于納米藥物進一步產(chǎn)業(yè)化和臨床應用具有重要意義。隨著納米技術的發(fā)展，精細納米復合材料的優(yōu)化和操作以及表面相互作用的研究越來越受到重視，利用納米復合材料可以進一步提高體內(nèi)治療效果，降低副作用。
因此，了解結(jié)構-功能關系的內(nèi)在聯(lián)系仍然是納米醫(yī)學發(fā)展的第一要務，特別是對納米藥物體內(nèi)行為的無創(chuàng)可視化。為了應對這些挑戰(zhàn)，化學家和生物學家在開發(fā)原位監(jiān)測體內(nèi)納米藥物代謝行為的成像技術方面做出了巨大努力。目前的方法主要是將化學標記嵌入納米藥物中，包括熒光探針、光聲試劑、同位素標記等。這些探針的一個共同的局限性是它們的空間分辨率相對較低，尤其是對于深部組織。因此，對體內(nèi)納米藥物在深部組織中的代謝和分布進行監(jiān)測仍然面臨挑戰(zhàn)。近年來，近紅外二區(qū)（NIR-II，1000-1700nm）成像技術以其低背景噪聲、高空間分辨率、高靈敏度等優(yōu)點成為腫瘤和腦深部成像的一種新的工具，并在臨床前藥物開發(fā)中發(fā)揮著重要作用。近幾年在近紅外-Ⅱ技術方面取得的成就已經(jīng)證明可以在高分辨率下實現(xiàn)20毫米的組織穿透。然而，具有高性能的NIR-II發(fā)光團仍然很少見，許多發(fā)光團在NIR-II處的信號很弱?；诠w-受體-供體（D-A-D）的主鏈結(jié)構，近紅外-Ⅱ試劑已被廣泛構建。用于構建NIR-II發(fā)射分子的受體核通常僅限于苯并雙噻唑（BBT）單元。
因此，尋找可供選擇的NIR-II核心單元以擴展為具有明顯NIR-II信號的NIR-II材料庫是一個根本性的挑戰(zhàn)。在本研究中，研究者試圖探索噻二唑苯并三唑（BTZ）作為一種可替代的近紅外-Ⅱ型熒光團（DTTB），它在808nm處具有13.4%的高熒光量子產(chǎn)率和4.9×104L mol-1cm-1的大吸收系數(shù)。此外，獲得的NIR-II熒光團DTTB被結(jié)合到聚乙二醇膠束中，以非侵入性地方式顯示納米藥物在體內(nèi)的代謝行為（圖1）。利用全身成像技術，研究了納米膠束的PEG長度對其在血液中循環(huán)時間的影響。通過NIR-II熒光和光聲雙模成像可以清楚地顯示腫瘤的靶向性。此外，優(yōu)化后的納米藥物經(jīng)近紅外輻照后，實現(xiàn)了高效的腫瘤清除。這項工作提供了一種替代性的高熒光近紅外-Ⅱ熒光團，可用于體內(nèi)納米藥物的實時藥物評價。
圖1. 利用近紅外-Ⅱ熒光和光聲雙模型成像實時評價聚乙二醇化納米藥物的藥物行為示意圖
該研究合成一種可替代的D-A-D共軛低聚物（DTTB），其NIR-II發(fā)射峰在~1000nm處，熒光量子產(chǎn)率高達13.4%，吸收系數(shù)高達4.9×104?L mol-1?cm-1。通過將DTTB分子結(jié)合在DSPE-PEG上得到三種DTTB@PEG，制備出具有不同鏈長PEG修飾的NMs，并表現(xiàn)出了固有的熒光和光聲成像能力。采用NIR-II熒光和光聲成像技術，以實時、無創(chuàng)的方式，對NMs的聚乙二醇化相關藥物行為進行了綜合評價。
實驗方法
體內(nèi)光聲成像
小鼠麻醉，氧氣流量為2 L/min，混合3%異氟醚，并在37℃的加溫動物床上保持麻醉狀態(tài)。圖像是通過Vevo LAZR系統(tǒng)（FUJIFILM VisualSonics, Toronto, Canada）獲得的。帶有4T1腫瘤（皮下）的BALB/c裸鼠靜脈注射聚乙二醇化NM(DTTB@PEG-1K, DTTB@PEG-3K，和DTTB@PEG-5K；100μL，1.0 mg/mL），當腫瘤體積約為100 mm3時。在680、730、790和910nm的激光照射下，在注射后不同時間采集光聲圖像。
實驗結(jié)果
納米藥物（NMs）的結(jié)構特性（表面、形狀、成分和尺寸）對其在體內(nèi)的藥物特性有很大的影響。尤其是用聚乙二醇（PEG）修飾NMs的表面，即PEG化后，可通過避免NMs的聚集和吞噬來延長NMs的系統(tǒng)循環(huán)時間，從而提高NMs輸送到目標組織的概率。盡管聚乙二醇化對NMs系統(tǒng)藥代動力學的影響已經(jīng)被研究了幾十年，但對這一問題的深入研究卻很少以實時可見的方式進行。與傳統(tǒng)的藥物評價方法相比，生物醫(yī)學成像技術（MRI、PET、photo imaging等）具有無創(chuàng)性的特點，無需犧牲大量動物即可實現(xiàn)體內(nèi)藥效學行為的實時監(jiān)測和定量。將活體成像技術應用于藥物評價，可以大大提高制藥行業(yè)從實驗室概念到商業(yè)產(chǎn)品的效率。因此，在DTTB體外良好的近紅外熒光特性的基礎上，研究者通過NIR-II熒光和光聲雙模成像來評價NMs與各種PEG配體在體內(nèi)的藥物分布。制備了一個小的納米藥物庫，這些納米藥物與各種PEG配體結(jié)合，包括DTTB@PEG-1K, DTTB@PEG-3K，和DTTB@PEG-5K。以聚乙二醇化NMs為研究對象，研究了PEG鏈長度對4T1荷瘤小鼠體內(nèi)給藥效率和藥代動力學的影響。NIR-II熒光成像和光聲成像如圖2所示。注射后6-24小時，腫瘤區(qū)域的近紅外-Ⅱ熒光強度和光聲強度均顯著增加，由于增強的通透性和EPR效應，聚乙二醇化NMs在腫瘤區(qū)域逐漸積聚。聚乙二醇化NMs在腫瘤區(qū)域的富集也通過光聲和熒光信號強度在體內(nèi)進行半定量（圖2B和D）。值得注意的是DTTB@PEG-3K在腫瘤部位的信號增強最為明顯。于注射后36h采集小鼠主要臟器和腫瘤組織，用NIR-II熒光成像法進行組織分布定量。雖然在肝臟和脾臟中觀察到最強的熒光，但與其他器官相比，腫瘤呈現(xiàn)出非常明顯的熒光信號。圖2E中的量化報告顯示DTTB@PEG-3K（10.16±2.95%ID/g）相比于DTTB@PEG-1K（3.44±1.21% D/g）和DTTB@PEG-5K（5.41±1.55% ID/g）攝取效率最高。這意味著NMs的腫瘤部位積聚與PEG鏈長度有關。對NMs在血管中的循環(huán)行為進行詳細的無創(chuàng)體內(nèi)研究，結(jié)果表明了DTTB@PEG-3K具有更長的循環(huán)壽命。此外，藥代動力學研究證實了DTTB@PEG-3K（1.49小時）相比于TB@PEG-1K（0.54小時）和DTTB@PEG-5K（0.95小時）在體內(nèi)停留的時間更長。納米顆粒表面能呈現(xiàn)出不同的PEG分子構象狀態(tài)，這與PEG鏈長和納米粒子表面的PEG密度密切相關。納米粒子表面PEG層的結(jié)構構象對納米粒子在血清中的膠體穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)吸附有顯著影響，從而對納米粒子在血液中的循環(huán)時間有根本性影響。因此，研究者TTB@PEG-3K的循環(huán)時間較長是由于PEG分子表面的構象，DTTB@PEG-3K能有效地抑制補體化合物在納米粒子上的吸附，導致單核吞噬細胞系統(tǒng)（MPS）對納米粒子的攝取減少，有助于延長血液循環(huán)時間。
圖2. 4T1荷瘤小鼠靜脈注射后不同時間獲得的具有代表性的體內(nèi)光聲圖像（A）和DTTB@PEG-1K, DTTB@PEG-3K，和DTTB@PEG-5K在NIR-II熒光圖像（C）
4T1腫瘤區(qū)不同時間光聲（B）和NIR-II熒光（D）信號的半定量分析。E、 DTTB@PEG-1K, DTTB@PEG-3K，和DTTB@PEG-5K注射后36小時的體內(nèi)分布。F、 實時記錄裸鼠靜脈注射后60分鐘內(nèi)的活體血管成像DTTB@PEG-1K, DTTB@PEG-3K，和DTTB@PEG-5K。G、 基于橫截面剖面的Vesselwhm寬度分析（F中的紅線）。H、 DTTB@PEG-1K，和DTTB@PEG-5K靜脈注射后的藥物動力學分析。擬合曲線為R2值分別為0.9756、0.9961和0.9882的單相衰減函數(shù)。循環(huán)半衰期（t1/2）分別為0.95、1.49和0.54小時（數(shù)據(jù)以平均值±標準差表示，n=3。統(tǒng)計學分析采用雙尾不配對t檢驗）。
結(jié)論
綜上所述，研究者利用NIR-II熒光納米平臺對聚乙二醇化納米藥物進行實時藥劑學評價的方法。所設計的NIR-II發(fā)光體在808nm處具有較大的吸收系數(shù)，在NIR-II窗口具有較高的熒光量子產(chǎn)率。用NIR-II型發(fā)光體結(jié)合聚乙二醇化形成納米藥物并監(jiān)測其再體內(nèi)的代謝行為。體內(nèi)NIR-II熒光和光聲成像結(jié)果表明，適當?shù)木垡叶蓟兄谘娱L在血液中停留的時間、提高腫瘤靶向性及良好的生物安全性，從而實現(xiàn)長循環(huán)NIR-II納米藥物的高效光熱治療。本研究提出了一個在體內(nèi)對納米藥物進行實時藥物評價的方法，并展示了NIR-II納米平臺在納米藥物開發(fā)中的潛力。